Por Claudio Kiyoshi Hirai*/
O Teste do LAL é utilizado na
determinação das endotoxinas bacterianas em produtos injetáveis. O
princípio do teste baseia-se no processo de coagulação que ocorre com a
hemolinfa do Limulus polyphemus na presença de
lipopolissacarídeos.
O processo de coagulação da
hemolinfa do Limulus ocorre por meio de uma série de reações em cadeia
similares ao processo de coagulação do sangue em mamíferos. Os
responsáveis pela coagulação da hemolinfa dos caranguejos Limulus polyphemus
são os amebócitos, os principais componentes da hemolinfa deste animal. Os
amebócitos cumprem nos invertebrados um papel semelhante ao dos glóbulos
brancos dos vertebrados, defendendo o organismo de agentes patogénicos e libertando
uma série de enzimas como resposta a endotoxinas provenientes das bactérias. Os
investigadores estudaram este fenômeno até conseguirem comprovar que ao diluir
um lisado dos amebócitos extraídos do caranguejo ferradura em meio aquoso,
podem ser detectadas quantidades muito pequenas de endotoxinas.
As endotoxinas são complexos
de alto peso molecular associadas à membrana externa de bactérias Gram
negativas. São a maior fonte de pirogênio nos produtos injetáveis fabricados
pela indústria farmacêutica.
Os amebócitos contêm enzimas
pro-coagulantes que desencadeiam uma cascata de reações. O produto final destas
reações em cadeia é um gel composto por proteínas coaguladas. A resposta
enzimática é produzida ao contato dos amebócitos com as endotoxinas. Este
mecanismo é comparado frequentemente como o da tripsina que também desencadeia
uma cascata de reações para finalmente formar a trombina, responsável pela
coagulação do sangue em humanos.
O teste do gel clot é
comercializado desde a década de 1970, baseando-se na formação do gel. Volumes
iguais do reagente e da solução a ser analisada são transferidos a tubos de
ensaio. Esta mistura é incubada a 37ºC durante 1 hora. O ponto final da
reação é verificado através da inversão dos tubos a 180º, sendo que a presença
do gel que se mantém sólido durante a inversão é considerado positivo para a
presença de endotoxinas.
A Farmacopéia Brasileira na
sua 5ª edição descreve o método da formação do gel, turbidimétrico ou
colorimétrico do tipo cinético. Sendo que o método de formação do
gel deve ser validado de acordo com a recomendação farmacopéica.
MÉTODO DE COAGULAÇÃO EM GEL:
baseado na formação de coágulo ou gel (método semi-quantitativo).
MÉTODOS FOTOMÉTRICOS
quantitativos que incluem: O MÉTODO TURBIDIMÉTRICO, (baseado no desenvolvimento
de turbidez após quebra de um substrato endógeno); O MÉTODO CROMOGÊNICO
(baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um complexo peptídeo
sintético cromógeno).
O reagente LAL (lisado de
amebócito de Limulus sp.) é preparado para as leituras turbidimétricas ou
colorimétricas e estes procedimentos podem ser utilizados se cumprirem os
requisitos dos métodos. Para sua calibração é necessária a elaboração de uma
curva padrão obtendo-se a sua regressão linear, na qual se determina, por
interpolação, a concentração de endotoxina da substância sob teste.
O procedimento inclui
incubação da endotoxina padrão para obtenção de uma curva de calibração e das
soluções controle com reagente LAL, por tempo pré-determinado e leitura
espectrofotométrica no comprimento de onda adequado. No caso do procedimento do
método turbidimétrico, a leitura é feita imediatamente após período final de
incubação, e para o procedimento colorimétrico a reação enzimática é
interrompida no final do tempo pré-determinado pela adição do reagente, antes
das leituras. Para os procedimentos cinéticos turbidimétricos e colorimétricos
os valores de absorvância medida durante o período da reação e valores de
velocidades são determinados para aquelas leituras.
Alguns produtos injetáveis
podem apresentar problemas nos ensaios de endotoxina, por exemplo drogas
insolúveis em água (suspensões), medicamentos baseados em associações,
medicamentos quimioterápicos, medicamentos com atividades similares a
endotoxina, etc.
A validação deve demonstrar
que as amostras não interferem no ensaio de LAL sendo que 2 fatores devem ser
considerados; determinação da sensibilidade do LAL, e determinação da
potencialização ou inibição do teste.
*Claudio Kiyoshi Hirai
Gerente Técnico Biolab
55 11 3573-2905
55 11 3573-6812
0 comentários:
Postar um comentário